안저 스팟 스케일을 사용한 전방 유전자 스크리닝은 쥐의 망막 항상성에서 Lipe의 필수적인 역할을 확인합니다

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 533(2023) 이 기사 인용

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소교세포는 많은 망막 질환의 발병에 중요한 역할을 합니다. 생쥐의 안저 반점은 종종 활성화된 망막하 미세아교세포의 축적과 관련이 있습니다. 여기에서 우리는 화학적으로 유도된 돌연변이와 안저 반점 표현형 사이의 원인 연관성을 식별하기 위해 편향되지 않은 최첨단 과학 전달 유전학 파이프라인과 함께 반정량적 안저 반점 채점 척도를 사용합니다. 여러 연관성 중에서 우리는 C57BL/6J 마우스의 노란색 안저 반점의 증가와 관련된 Lipe의 과오 돌연변이에 중점을 둡니다. CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 생성된 Lipe-/- 마우스는 망막하 미세아교세포의 축적, 시각 기능 저하로 인한 망막 변성 및 비정상적인 망막 지질 프로필이 발생하는 것으로 밝혀졌습니다. 우리는 망막/RPE 지질 항상성과 망막 건강에 있어 Lipe의 필수적인 역할을 확립합니다. 이 새로운 모델을 사용한 추가 연구는 지질 조절 장애가 망막하 미세아교세포의 활성화를 어떻게 초래하는지, 그리고 이러한 미세아교세포가 후속 망막 변성에 역할을 하는지 여부를 결정하는 것을 목표로 할 것입니다.

많은 연구에서 활성화된 망막 미세아교세포와 연령 관련 황반 변성(AMD), 망막 이영양증 및 당뇨병성 망막증1,2,3,4,5,6,7,8,9과 같은 질병 사이의 연관성이 밝혀졌습니다. 이들 세포가 유해한지(염증 촉진을 통해)9,10,11,12,13,14,15 항상성인지(잔해 제거를 통해)16인지에 대해서는 여전히 논쟁이 있습니다. 실제로, 다른 상황에서는 7,10,17,18,19,20 중 하나일 수 있습니다. 우리는 망막하 미세아교세포의 축적을 조절하는 유전자를 식별하는 것이 망막 항상성에 필수적인 경로를 식별하는 데 도움이 될 것이라고 제안합니다. 또한, 생성된 마우스 모델의 주의 깊은 특성화는 망막의 면역 감시, 세포 밀매 및 신경염증을 조절하는 메커니즘에 대해 어느 정도 밝힐 수 있습니다. 이러한 목표를 염두에 두고 여기에서는 다른 순유전학 프로토콜에 비해 가장 큰 장점이 있는 최첨단 과학 순유전학 파이프라인에 안저 스폿 스케일 화면을 적용합니다. , 선별된 모든 마우스는 모든 돌연변이 유전자좌에서 사전 유전자형이 분석된 G3 마우스이므로 원인 돌연변이를 신속하게 확인할 수 있다는 사실입니다22. 이는 우리에게 다른 사람들이 무시할 수 있는 유전자 표현형 연관성을 추구할 수 있는 기회를 제공합니다. 전통적인 순방향 유전자 스크린에서는 잠재적인 "적중"을 추구하는 데 엄청난 노력이 필요합니다. 그 중 다수가 원인 돌연변이를 후향적으로 식별하기 위해 엑솜 시퀀싱과 함께 매핑 계통에 대한 이종교배/상호교배를 활용하기 때문입니다. 태워 버리는. 이는 심각한 병리로 이어지지 않는 연관성을 추구하는 것을 방해합니다.

다양한 모델의 마우스 안저 사진에서 볼 수 있는 흰색/노란색 망막하 반점의 정확한 구성은 완전히 확실하지 않지만, 우리와 다른 사람들은 이전에 Iba1+ 망막하 미세아교세포와 잘 상관관계가 있음을 보여주었습니다. 우리는 이러한 지점에 대해 신속하고 재현 가능한 반정량적 분석을 수행하기 위해 scale33을 개발했습니다. 여기에서 우리는 이 안저 스팟 스케일을 사용하여 야생형 마우스에 비해 안저 스팟 점수를 변경한 돌연변이에 대해 6000마리에 가까운 G3 마우스를 선별했습니다. 우리는 돌연변이가 발생하면 안저 반점이 축적되는 여러 유전자를 확인했습니다. 이들 유전자 중 6개는 이미 망막 병리를 유발하는 것으로 알려져 있으며(보충 표 S1), 이는 원리 증명을 제공합니다. 유전자-표현형 연관성에서 우리는 Lipe 유전자의 돌연변이가 안저 반점 축적의 강력한 표현형을 초래하고 안저 반점 척도가 이를 식별할 수 있는 유일한 선별 매개변수이기 때문에 Lipe 유전자를 추구하기로 결정했습니다.

이 연구에서 우리는 또한 CRISPR로 생성된 Lipe-/- 마우스 라인이 망막 사진에서 안저 반점이 광범위하게 축적된 결과를 재현한다는 것을 보여줍니다. 우리는 망막하 미세아교세포의 축적과 망막 변성이 발생한다는 것을 보여줍니다. 그런 다음 망막 영상, 망막 해부학 및 미세 구조, 현장 혼성화, 전기 생리학 및 면역 조직 화학에 중점을 두고 이러한 쥐의 특성을 분석합니다. 마지막으로 질량 분석법을 갖춘 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 Lipe-/- 마우스가 망막과 RPE의 지질 대사에 이상을 나타냄을 보여줍니다.