제브라피시 유충 감염 모델의 향후 적용을 위한 비표적 대사체 연구를 위한 추출 방법 평가

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 7489(2023) 이 기사 인용

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비표적 대사체학의 시료 준비에서는 가능한 한 많은 분자를 재현성 있게 추출할 수 있어야 합니다. 따라서 시료 준비를 최적화하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 감염 모델의 맥락에서 제브라피시 유충을 추출하는 데 가장 적합한 방법을 찾기 위해 6가지 다른 추출 절차를 비교했습니다. 메탄올(I)과 단일 혼합상 메탄올/아세토니트릴/물(II)을 사용하는 2개의 1상 추출과 클로로포름과 메탄올/물 조합(III 및 IV) 사이의 상 분리를 사용하는 2개의 2단계 추출 방법을 테스트했습니다. 추가 비드 균질화는 방법 III 및 IV(III_B 및 IV_B)에 사용되었습니다. 마이코박테리아 감염과 관련된 9개의 내부 표준과 59개의 관심 분자(MoInt)가 방법 평가에 사용되었습니다. 2단계 방법(III 및 IV)은 1단계 추출에 비해 특징 개수가 적고, MoInt, 특히 아미노산의 피크 면적이 높고, 변동 계수가 더 높습니다. 비드 균질화를 추가하면 특징 수, 피크 면적 및 CV가 증가했습니다. 추출 I은 추출 II보다 더 높은 피크 면적과 더 낮은 CV를 보여 가장 적합한 1상 방법이었습니다. 추출 III과 IV는 비슷한 결과를 보였으며 III이 실행하기 쉽고 부정확성이 덜한 것으로 나타났습니다. 따라서 향후 zebrafish 유충 대사체학 및 감염 모델에 적용하기 위해 추출 I 및 III이 선택될 수 있습니다.

대사체학은 특정 시점에서 유기체 또는 모델 시스템에 존재하는 < 1500 Da(대사체) 분자의 변화를 분석적으로 프로파일링하는 것을 목표로 합니다1,2. 대사체에는 내인성 대사산물뿐만 아니라 약물과 같은 외인성 소스에서 유래하는 대사산물도 포함됩니다. 표적화된 접근법은 주로 특정 대사산물 그룹에서 선택된 대사산물의 정량화를 기반으로 하는 반면, 비표적 대사체학은 가능한 한 많은 대사산물을 검출하는 것을 목표로 합니다1,2,3. 시료 분리를 위해 종종 적용되는 분석 기술에는 액체 크로마토그래피(LC)와 가스 크로마토그래피가 포함되며, 둘 다 정기적으로 질량 분석기와 결합됩니다1,2,3. 비표적 접근법의 LC 분리는 종종 비극성 대사산물 분리를 위한 역상 컬럼, 극성 대사산물 분리를 위한 순상 컬럼 또는 순상 컬럼의 변형인 HILIC(친수성 상호작용 액체 크로마토그래피) 컬럼을 사용하여 수행됩니다. 고정상 위에 물층이 생겨서 주로 액체-액체 분할을 기반으로 분리됩니다. 페닐-헥실 컬럼은 방향족 분자에 대한 독특한 선택성을 갖춘 역상 컬럼입니다. 대사산물을 분리한 후 일반적으로 ESI(electrospray ionization) 또는 대기압 이온화를 사용하여 이온화하고 Orbitrap 또는 비행 시간 기기1,2와 같은 질량 분석기를 사용하여 분석합니다. 조각화 스펙트럼은 데이터 종속적 또는 데이터 독립적 획득 등을 사용하여 동일한 분석에서 생성되거나 후속 분석에서 생성될 수 있습니다. 이렇게 생성된 데이터는 피크 검출 및 전처리와 같은 생물정보학 방법을 사용하여 추가 처리될 수 있으며, 식별을 위한 참조 라이브러리에 대한 단편화 스펙트럼의 평가 및 비교를 위한 다변량 통계가 뒤따릅니다1,2,3,4,5.

결핵과 같은 질병의 영향을 이해하고 진단 또는 치료 성공을 위한 바이오마커를 찾기 위해 종종 대사체학을 적용하고 숙주 대사체의 변화를 관찰합니다. 구체적으로, 결핵균 감염에서 발생하는 내인성 대사체의 변화는 인간4,5,6,7 및 생쥐, 기니피그, 토끼 및 비인간 영장류9를 포함한 동물 모델8에서 광범위하게 연구되었습니다. 대사체에 유도된 변화는 제브라피시 유충(Danio rerio, ZF)의 비결핵 마이코박테리움 M. marinum을 자연 숙주 중 하나로 사용하여 연구되었습니다. M. marinum을 사용하는 이러한 ZF 모델은 일반적으로 포유류 대응물에서 발견되는 구조와 같은 육아종과 유사합니다. ZF 게놈은 인간의 게놈과 약 70% 동일하며15 여러 연구에서 이물질 대사16,17,18,19 및 감염의 경우 숙주 대사체20,21와 관련하여 인간과 유사한 대사가 보고되었습니다. ZF 유충 모델은 다른 유기체에 비해 취급 용이성, 배아 및 유충의 광학적 투명성, 낮은 금전적 비용을 포함하는 추가 장점을 가지고 있습니다. 또한, 수정 후 120시간(hpf)보다 어린 배아와 유충을 대상으로 수행된 실험은 유럽 연합 내에서 동물 실험으로 간주되지 않습니다(EU 지침, 2010/63/EU)24. 다양한 장점으로 인해 비표적 대사체학을 사용하는 ZF 연구가 요즘 점점 더 일반화되고 있지만25,26 질병과 특히 M. marinum의 맥락에서는 거의 사용되지 않습니다20.